Lokalisasi Subseluler APG-9 pada Sel YW5-1B
Eksperimen pulse/chase dan steady-state kami menunjukkan bahwa galur mutan cvt tidak mengakumulasi prAPI yang resistan terhadap protease dalam kondisi pertumbuhan yang permisif. Temuan ini konsisten dengan pengamatan bahwa Apg9p diperkaya dalam kompartemen membran yang diidentifikasi oleh analisis gradien sukrosa.
Imunofluoresensi dan mikroskopi elektron imunogold mengungkapkan bahwa ekspresi ektopik Apg9p yang menyatu dengan GFP menunjukkan satu hingga beberapa struktur punctate proksimal terhadap membran vakuolar, tetapi struktur ini tidak diamati menyatu dengan badan autofagik atau autofagosom sitoplasma.
Lokasi subseluler
Lokasi subseluler protein merupakan aspek penting dalam mengidentifikasi fungsi biologisnya. Cara tradisional untuk mempelajari lokalisasi subseluler adalah melalui imunolabeling atau penandaan dengan protein fluoresen. Namun, metode ini mahal dan memakan waktu. Baru-baru ini, beberapa model pembelajaran mesin telah dikembangkan untuk mengidentifikasi gen dan lokalisasi subselulernya. Model-model ini menghubungkan anotasi gen, seperti istilah GO dan jalur KEGG, dengan lokalisasi subseluler menggunakan model matematika.
Autofagi adalah jalur katabolik yang dilestarikan di mana vesikel membran ganda menelan makromolekul atau organel. Vesikel kemudian menyatu dengan lisosom untuk degradasi. Banyak protein yang diperlukan untuk pembentukan vesikel telah diidentifikasi melalui pemeriksaan genetik pada ragi. Protein-protein ini biasanya terlokalisasi pada struktur perivakuolar yang disebut PAS. PAS adalah kompartemen yang berbeda dari retikulum endoplasma (ER) dan dapat divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi. PAS mengandung lipid scramblase, Vps34, yang penting untuk autofagi. Pada sel mamalia, Vps34 berinteraksi dengan 2 kompleks PtdIns 3-kinase lainnya, Apgl1 dan Apgl2. Interaksi ini mendorong pergerakan vesikel dari aparatus Golgi ke PAS. Hidrofobisitas
Urutan Apg9p mengkodekan protein dengan massa molekular yang diprediksi sebesar 115 kD. Topologi protein ATG9A yang diprediksi menunjukkan bahwa protein tersebut merupakan trimer obligat dengan pori sentral yang terbuka ke sitosol dan pori/cabang lateral yang berorientasi ke arah lapisan luar membran.
Analisis hidrofobisitas protein ATG9A menunjukkan daerah kaya prolin yang signifikan dan residu polar pada terminal NH2 dan COOH. Protein ATG9A juga mengandung motif penyortiran berbasis tirosin (YxxPh) yang diketahui penting untuk pengangkutan dalam sistem autofagi.
Sferoplas galur apg9ts diberi label pulsa selama 10 menit diikuti oleh reaksi pengejaran selama 30 menit pada suhu yang tidak permisif dan kemudian dilisis secara osmotik dan dipisahkan menjadi fraksi supernatan dan pelet (P2) berkecepatan rendah. Mayoritas prAPI dalam galur apg9ts muncul dalam fraksi pelet P2, yang menunjukkan bahwa ia terkait dengan kompleks yang larut tetapi dapat dipeletkan dalam jumlah besar. Menariknya, kemampuan pelet kompleks apg9ts yang bergantung pada garam tidak diamati ketika protein APG 9 dihilangkan dengan prosedur ekstraksi deterjen.
Integritas
Untuk menentukan fungsi Apg9p, kami mengganggu lokus kromosomnya melalui dua pendekatan. Pertama, strategi berbasis PCR digunakan untuk menghasilkan konstruksi yang mencakup penanda auksotrofik HIS3 yang diapit oleh urutan dari awal dan akhir ORF APG9. Plasmid ini, p8007, dicerna dengan EcoRI dan ditransformasikan ke dalam sel tipe liar YW5-1B. Plasmid ini mampu melengkapi cacat autofagi galur apg9D, sebagaimana dibuktikan oleh analisis tetrad dan akumulasi prekursor API. Lokalisasi perivakolar Apg9p pada mutan vps4D dan apg6D/vps30D menunjukkan bahwa ia mungkin terlibat dalam autofagi melalui mekanisme yang melibatkan sekuestrasi membran. Namun, terlepas dari lokasinya yang perivakolar, Apg9p tidak melakukan kofraksinasi dengan protein penanda autophagosomal Pep12p dalam gradien sukrosa, dan tidak pernah diamati mengalami peristiwa fusi homotipe. Hasil ini menunjukkan bahwa Apg9p terlokalisasi ke kompartemen membran baru yang berkontribusi pada pembentukan vesikel Cvt dan autophagosom. Namun, identitas pasti dari kompartemen ini tidak diketahui.